主　　旨： 公告訂定「食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗」為食品衛生管理法所定之食品衛生檢驗方法，如附件。

依　　據： 食品衛生管理法第二十五條。

署　　長　侯勝茂
　　　　　  本案依分層負責規定授權局長決行

食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗

1      適用範圍：本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。

2      檢驗方法：

2.1      工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。

2.2      器具及材料：

2.2.1       乾熱滅菌器。

2.2.2       高壓滅菌釜。

2.2.3       攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：適用於無菌操作者。

2.2.4       天平：可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g；可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。

2.2.5       冰箱：能維持5 ± 3℃者。

2.2.6       吸管或吸管尖：已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。

2.2.7       吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。

2.2.8       稀釋瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。

2.2.9       培養皿：已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。

2.2.10      增菌用容器：附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶；玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。

2.2.11      pH測定儀。

2.2.12      培養箱：能維持內部溫度在± 1℃以內者。

2.2.13      溫度計：量測溫度範圍1∼55℃，最小刻度0.1℃。

2.2.14      水浴：加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在 ± 0.2℃以內者。

2.2.15      接種針及接種環（直徑約3 mm）：鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。

2.2.16      曲玻棒：可滅菌者，直徑3∼4 mm，塗抹區域45∼55 mm。

2.2.17      試管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm試管，或其他適用者。

2.2.18      旋渦混合器（Vortex mixer）。

2.2.19      顯微鏡：能放大至1000倍以上之一般光學顯微鏡。

2.2.20      載玻片及蓋玻片：適用於染色及鏡檢用。

2.2.21      研缽、杵。

2.2.22      藥勺、剪刀、小刀、鑷子：可滅菌。

2.2.23      濾紙及褐色試藥瓶。

2.2.24      無菌濾膜：孔徑0.45 μm或以下之親水性醋酸纖維膜。

2.2.25      杜蘭發酵管（Durham fermentation tube）：外徑9 × 22 mm或其他適用者。

2.2.26      試藥：氯化鈉、硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）、膽鹽No. 3（bile salts No. 3）、中性紅（neutral red）、結晶紫（crystal violet）、檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）、去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）、硫代硫酸鈉（sodium thiosulfate）、草酸銨（ammonium oxalate）、碘化鉀、碘、沙黃O（safranin O）、對-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基對位苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine•2HCl）、磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄•H₂O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮綠（brilliant green）、酚紅（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草藍（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基紅（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氫氧化鉀、95%乙醇、無水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或異戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化鉀、氫氧化鈉、L-離胺酸（L-lysine）、L-鳥胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、礦物油或液態石蠟油（paraffin oil）及鹽酸等均採用化學試藥級。

2.2.27      試劑：

2.2.27.1   無菌蒸餾水：

　　　　　　蒸餾水900 mL、90 mL、9 mL，分裝於增菌容器或試管中，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.2   0.85%生理食鹽水：

　　　　　　取氯化鈉8.5 g溶於1000 mL蒸餾水中，分裝於試管內，以121℃滅菌15分鐘。

2.2.27.3   柯瓦克氏試劑（Kovacs’ reagent）：

　　　　　　取對-二甲胺基苯甲醛5 g溶於戊醇或異戊醇75 mL中，再徐徐加入鹽酸25 mL，混合均勻後應呈黃色並須保存於4℃冰箱中。

2.2.27.4   甲基紅指示劑（Methyl red indicator）：

　　　　　   取甲基紅0.1 g溶於95%乙醇300 mL後，再加蒸餾水使成500 mL。

2.2.27.5   歐普氏試劑（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）：

　　　　　   溶液A：取α-萘酚5 g溶於無水乙醇100 mL中。

　　　　　   溶液B：取氫氧化鉀40 g溶於蒸餾水中，並使成100 mL。

2.2.27.6   0.5%氰化鉀溶液（0.5% potassium cyanide solution）：

　　　　　   取氰化鉀0.5 g溶於無菌蒸餾水100 mL中（氰化鉀為劇毒物質，本操作務必在抽氣櫃內進行）。

2.2.27.7   礦物油或液態石蠟油：

　　　　　   取礦物油或液態石蠟油20∼50 mL，裝入有蓋容器中約1/2滿，以121℃滅菌30分鐘。

2.2.27.8   革蘭氏染色液（Gram stain solution）：

2.2.27.8.1   哈克氏（Hucker’s）結晶紫液（初染劑）：

　　　　　　   溶液A：取結晶紫2 g溶於95%乙醇20 mL中。

　　　　　　   溶液B：取草酸銨0.8 g溶於蒸餾水80 mL中。

　　　　　　   將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。

2.2.27.8.2   革蘭氏碘液（媒染劑）：

　　　　　　   取碘化鉀2 g及碘1 g置於研砵中，經研磨5∼10秒鐘後，加蒸餾水1 mL研磨，次加蒸餾水5 mL研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗滌研砵及杵後，併入洗液，加蒸餾水使成300 mL。

2.2.27.8.3   哈克氏複染液（複染劑）：

　　　　　　   取沙黃O 2.5 g溶於95%乙醇100 mL中，供作複染原液。使用時，取原液10 mL加蒸餾水90 mL，作為複染液。

　　　　 註：革蘭氏染色液因放久可能失效，因此若購買成品時，要注意其保存期限，若自行配製者應檢查其染色效果。

2.2.27.9   氧化酶試劑（Oxidase reagent）：

　　　　　　   取四甲基對位苯二胺鹽酸鹽1 g溶於蒸餾水100 mL後，貯存於褐色瓶，並置入冰箱中，使用期限以不超過1星期為宜。

2.2.27.10 1 M磷酸二氫鈉溶液：

　　　　　　   取磷酸二氫鈉6.9 g溶於蒸餾水45 mL中，徐徐注入30%氫氧化鈉溶液約3 mL，調整pH值為7.0，續加入蒸餾水使成50 mL，貯存於4℃冰箱中備用。

2.2.27.11 硝基苯哌喃半乳糖試劑（ONPG reagent）：

　　　　　　   取硝基苯哌喃半乳糖80 mg溶於37℃蒸餾水15 mL中，再加入1 M磷酸二氫鈉溶液5 mL，即為0.0133 M硝基苯哌喃半乳糖試劑，貯存於4℃冰箱中，使用時須加溫至37℃。

2.2.28      培養基：

2.2.28.1   蛋白腖緩衝液（Buffered peptone water, BPW）

蛋白腖（peptone）                                                                                  10 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        5 g

磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）                                                                      3.5 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）                                                                        1.5 g

蒸餾水                                                                                                   1000 mL

攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.2 ± 0.2。

2.2.28.2   加鹽硫酸月桂酸胰化蛋白 培養液（Lauryl tryptose broth with 2% NaCl, 2% NaCl-LST）

胰化蛋白 （tryptose）                                                                          20 g

乳糖（lactose）                                                                                           5 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）                                                                      2.75 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）                                                                      2.75 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        20 g

硫酸月桂酸鈉（sodium lauryl sulfate）                                                   0.1 g

蒸餾水                                                                                                    1000 mL

加熱溶解後，分取10 mL注入裝有杜蘭發酵管之試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8 ± 0.2。

2.2.28.3   紫紅膽鹽葡萄糖培養基（Violet red bile glucose agar, VRBG）

酵母抽出液（yeast extract）                                                                     3 g

蛋白腖（peptone）                                                                                    7 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        5 g

膽鹽No. 3（bile salts No. 3）                                                                  1.5 g

乳糖（lactose）                                                                                        10 g

中性紅（neutral red）                                                                           0.03 g

結晶紫（crystal violet）                                                                      0.002 g

洋菜（agar）                                                                                             15 g

葡萄糖（glucose）                                                                                   10 g

蒸餾水                                                                                                 1000 mL

　　　　　   加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度。於45∼50℃水浴中冷卻，最終pH值為7.4 ± 0.2。每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。配製後之培養基應放置於2∼8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。

2.2.28.4   阪崎腸桿菌培養基（Enterobacter sakazakii agar, ESA）

胰化蛋白腖（tryptone）                                                                           15 g

大豆蛋白腖（soya peptone）                                                                   5.0 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        5.0 g

檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate）                                                  1.0 g

去氧膽酸鈉（sodium desoxycholate）                                                     1.0 g

硫代硫酸鈉（Na₂S₂O₃．5H₂O）                                                            1.0 g

　　　　　　　   　  5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷
　　　　　　　  　（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）                                 0.1 g

洋菜（agar）                                                                                               15 g

蒸餾水                                                                                                    1000 mL

　　　　　　攪拌加熱溶解後，以121℃，滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。冷卻至50℃，每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用。

2.2.28.5   腸內細菌科增菌培養液（Enterobacteriaceae enrichment broth, EE broth）

蛋白腖（peptone）                                                                                  10 g

葡萄糖（glucose）                                                                                    5 g

磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）                                                                         8 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）                                                                         2 g

牛膽鹽（ox-gall）                                                                                  20 g

亮綠（brilliant green）                                                                         0.015 g

蒸餾水                                                                                              1000 mL

　　　　　　加熱至沸騰溶解，注意不可加熱過度，最終pH值為7.2 ± 0.2。取90 mL注入約125 mL已滅菌之附蓋三角錐瓶或廣口瓶中，配置後之培養液應放置於2∼8℃冰箱中保存，但須於一個月內使用完畢。

2.2.28.6   胰化酪蛋白大豆培養基（Trypticase soy agar, TSA）

胰化酪蛋白腖（trypticase peptone）                                                     15.0 g

植物蛋白腖（phytone peptone）                                                             5.0 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                     5.0 g

洋菜（agar）                                                                                           15 g

蒸餾水                                                                                              1000 mL

　　　　　　平板培養基配製方法：攪拌加熱溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。冷卻至50℃，每培養皿注入約20 mL，凝固後確定表面乾燥後使用；斜面培養基配製方法：加熱溶解後，分取約5 mL注入試管，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.3 ± 0.2。滅菌後作成斜面培養基，斜面長度約4∼5 cm，斜面底部之深度約2∼3 cm。

2.2.28.7   尿素培養液（Urea broth）

尿素（urea）                                                                                           20 g

酵母抽出物（yeast extract）                                                                  0.1 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）                                                                      9.1 g

磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）                                                                      9.5 g

酚紅（phenol red）                                                                              0.01 g

蒸餾水                                                                                              1000 mL

　　　　　   溶解後，經孔徑0.45 μm濾膜過濾後，分取1.5∼3 mL濾液，注入已滅菌之試管中，最終pH值為6.8 ± 0.2。

2.2.28.8   運動性試驗培養基（Motility test medium）

牛肉抽出物（beef extract）                                                                      3 g

蛋白腖（peptone）                                                                                  10 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        5 g

洋菜（agar）                                                                                             4 g

蒸餾水                                                                                              1000 mL

　　　　　　加熱溶解後，分取約8 mL注入附有螺旋蓋試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.4 ± 0.2。

2.2.28.9   氰化鉀培養液（Potassium cyanide broth）

聚蛋白腖（polypeptone）                                                                            3 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                          5 g

磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）                                                                     0.225 g

磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）                                                                     5.64 g

蒸餾水                                                                                                    1000 mL

　　　　　　溶解後，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.6 ± 0.2。冷卻後於抽氣櫃內以吸管輔助器配合無菌操作，加入0.5%氰化鉀溶液15 mL，混合均勻，分取1∼1.5 mL注入已滅菌之試管中，貯存於冰箱備用，貯存期限不得超過兩週（操作氰化鉀溶液時，需戴手套且不可用口吸取）。

2.2.28.10 胰化蛋白腖培養液（Tryptone broth）

胰化蛋白腖（tryptone）或胰化酪蛋白腖（trypticase）                          10 g

蒸餾水                                                                                           　　　 1000 mL

溶解後，分取約5 mL注入試管內，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ± 0.2。

2.2.28.11 MR-VP培養液（MR-VP broth）

蛋白腖緩衝液粉末（buffered peptone-water powder）                              7 g

葡萄糖（glucose）                                                                                   　 5 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）                                                                         　  5 g

蒸餾水                                                                     　　                   　 1000 mL

　　　　　　溶解後，分取約10 mL注入試管中，以118∼121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.9 ± 0.2。

2.2.28.12 溴甲酚紫培養液（Bromcresol purple broth）

蛋白腖（peptone）                                                                                  10 g

牛肉抽出物（beef extract）                                                                      3 g

氯化鈉（NaCl）                                                                                        5 g

溴甲酚紫（bromcresol purple）                                                             0.04 g

蒸餾水                                                                               　　           1000 mL

　　　　　　溶解後，分取約2.5 mL注入試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為7.0 ± 0.2。冷卻後，每管加入經0.2 μm孔徑濾膜過濾除菌之50%（w/v）蔗糖溶液0.278 ± 0.002 mL，使培養液中該糖之最終濃度為5%（w/v）。含半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿拉伯糖醇之溴甲酚紫培養液配製方法亦同。

2.2.28.13 脫羧酶基礎培養液（Decarboxylase basal medium）

蛋白腖（peptone）                                                                                    5 g

酵母抽出物（yeast extract）                                                                     3 g

葡萄糖（glucose）                                                                                    1 g

溴甲酚紫（bromcresol purple）                                                             0.02 g

蒸餾水                                                                                                1000 mL

　　　　　　加熱攪拌溶解後，取L-離胺酸5 g溶解於上述之培養液中，混合均勻，分取適量注入試管內，以121℃滅菌10分鐘，最終pH值為6.5 ± 0.2，使成離胺酸脫羧酶培養液。含L-精胺酸及L-鳥胺酸之脫羧酶培養液配製方法亦同。對照組之配製，除脫羧酶基礎培養液外，不需添加任何物質。

2.2.28.14 辛蒙斯檸檬酸鹽培養基（Simmons citrate agar）

氯化鈉（NaCl）                                                                                     　  5 g

檸檬酸鈉（Na₃C₆H5O₇）                                                                          2 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）                                                                           1 g

磷酸二氫銨（NH₄H₂PO₄）                                                                       1 g

硫酸鎂（MgSO₄）                                                                                  0.2 g

溴麝香草藍（bromthymol blue）                                                           0.08 g

洋菜（agar）                                                                                  　　   15 g

蒸餾水                                                                                              　 1000 mL

　　　　　　加熱溶解後，分取約5 mL注入試管中，以121℃滅菌15分鐘，最終pH值為6.8 ± 0.2。滅菌後作成斜面培養基，此斜面長度約4∼5 cm，斜面底部深度約2∼3 cm。

2.3      檢液之調製：

2.3.1       奶粉檢體（包括嬰兒配方奶粉、特殊營養配方奶粉、幼童專用奶粉及成人奶粉）：用振搖方式，使充分均勻混合後，以已滅菌之藥勺或其他方便使用之用具，取100 g、10 g及1 g，分別加入內含預熱至45℃之無菌蒸餾水900 mL、90 mL及9 mL之2 L、250 mL及125 mL三角錐瓶中（三重複）。以上三角錐瓶得以其他耐濕熱滅菌之塑膠材質容器或玻璃試管替代，唯檢液體積以不超過容器總容量二分之一為原則。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，於35℃培養18∼24小時，供作檢液。因檢液於增菌培養過程可能產氣，故不可緊鎖螺旋瓶蓋（或試管蓋），宜維持鬆動但不脫落狀態。

2.3.2       液態食品檢體：充分均勻混合後，取100 mL、10 mL及1 mL，分別加入內含900 mL、90 mL及9 mL已滅菌之蛋白腖緩衝液。充分混合均勻，即為三階三瓶（管）之10倍稀釋檢液，於35℃培養18∼24小時，供作檢液。

2.3.3       環境檢體或塗抹物檢體：

2.3.3.1     環境檢體：取1 g置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18∼24小時，供作檢液。

  2.3.3.2     塗抺物檢體：將塗抹棒之頭部置於已滅菌試管內，以無菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，添加蛋白腖緩衝液5 mL後，將試管蓋旋緊，於10秒內來回叩擊手心使其劇烈振盪（振盪幅度需達15公分）50次，或以旋渦混合器充分振盪至塗抹物頭部之棉絮鬆開。取溶出液1 mL置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，於44℃培養18∼24小時，供作檢液。

　　　　　　或將塗抹棒之頭部置於含2% NaCl-LST培養液10 mL之試管內，以無菌操作折（剪）斷塗抹物木柄，於44℃培養18∼24小時，供作檢液。

2.4      鑑別試驗：

2.4.1       選擇性增菌培養：吸取2.3節之檢液10 mL，加入內盛有腸內細菌科增菌培養液90 mL之160 mL稀釋瓶中。混合均勻後於35℃培養18∼24小時。

2.4.2       分離培養：

  2.4.2.1     方法一：自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中取一接種環量，在VRBG及ESA培養基表面劃線後（二重複），於35℃培養18∼24小時，觀察所形成菌落之形態。阪崎腸桿菌在VRBG培養基上的典型菌落為外緣規則平整，呈淡粉紅色或紫紅色，外緣通常伴有紫紅色之膽酸（bile acids）類物質沉殿環生成；阪崎腸桿菌在ESA培養基上的典型菌落為外緣規則平整，呈綠色。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培養基，於35℃培養18∼24小時後，進行下列初步生化試驗。

  2.4.2.2     方法二：自2.4.1節之腸內細菌科增菌培養液中吸取1 mL量，加入內盛有生理食鹽水9 mL之試管中，進行系列稀釋，使增菌培養液稀釋至原來的10^-4∼10^-6倍。每一管（含未稀釋之培養液）分別以無菌吸管吸取0.1 mL量，以曲玻棒均勻塗於VRBG及ESA培養基上，於35℃培養18∼24小時。自VRBG及ESA培養基上鉤取可疑菌落，劃線於TSA平板培養基，於35℃培養18∼24小時後，進行下列初步生化試驗。

2.4.3       混合菌株（Mixed culture）之純化：將VRBG及ESA培養基上之未純化菌株，以四區劃法，劃於VRBG或ESA培養基，於35℃培養18∼24小時後，鉤取典型菌落，劃線於TSA平板培養基，於35℃培養18∼24小時後，進行下列初步生化試驗。

2.5      鑑定試驗：

2.5.1       初步生化試驗：

  2.5.1.1     氧化酶試驗（Oxidase test）：以無菌接種針挑取可疑菌株，塗抹於含有氧化酶試劑之濾紙表面。10∼15秒後變為深紫色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為氧化酶負反應。

  2.5.1.2     黃色色素產生試驗（Yellow pigment production test）：以無菌接種針挑取TSA平板培養基上可疑菌株至少5株，分別劃於TSA斜面培養基上，以25℃培養48∼72小時，觀察菌株產生色素之情形。有黃色色素產生者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.1.3     尿素酶試驗（Urease test）：以無菌接種針挑取可疑菌株，接種於尿素培養液內，於35℃培養24 ± 2小時。由於未接種之尿素培養液偶爾會轉變為紫紅色，故試驗時應包括未接種之培養液作為對照用。培養液由橘紅色轉變為紫紅色者為正反應，顏色不變者為負反應，阪崎腸桿菌為負反應。

  2.5.1.4     運動性試驗（Motility test）：以無菌接種針挑取可疑菌株，穿刺接種於運動性試驗培養基之表面中央點至深度0.5吋處。於35℃培養24小時後開始觀察直至48 ± 2小時。當測試菌沿穿刺線呈放射線狀生長者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.1.5     革蘭氏染色（Gram stain）：以無菌接種針挑取可疑菌株，劃於TSA斜面培養基上，於35℃培養24 ± 2小時，依下列步驟進行革蘭氏染色後鏡檢。

　　　(１) 鉤取菌體，於載玻片上製成薄抹片，風乾或微熱固定。

　　　(２) 初染：將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘後水洗，水洗時間應不超過5秒鐘。

　　　(３) 媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。

　　　(４) 脫色：以95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再以水洗，此步驟需時甚短，僅數秒即可，惟視抹片之厚薄而定。

　　　(５) 複染：用哈克氏複染液複染30秒鐘，水洗。

　　　(６) 自然風乾。

　　　(７) 鏡檢：呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢之桿狀菌。

　　　　　經上述試驗，判定為可疑阪崎腸桿菌者，自TSA培養基鉤菌，進行下列生化試驗確認。

2.5.2       生化試驗：

  2.5.2.1     硝基苯哌喃半乳糖苷試驗（ONPG test）：鉤菌並置於含有已滅菌之0.85%生理食鹽水0.2 mL之試管中，作成濃懸浮液後，再加入一片浸過硝基苯哌喃半乳糖苷試劑之紙錠，並輕輕搖動後，於35℃培養6∼24小時，紙錠變成黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.2.2     氰化鉀試驗（KCN test）：鉤菌接種於氰化鉀培養液，以橡皮塞塞緊試管口，於35℃培養24小時後開始觀察直至48 ± 2小時。培養液由清澈變為混濁者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.2.3     吲哚試驗（Indole test）：鉤菌接種於胰化蛋白腖培養液中，於35℃培養48 ± 2小時後，加入柯瓦克氏試劑0.2∼0.3 mL，輕輕搖動後靜置約10分鐘，上層呈紅色者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。

  2.5.2.4     歐普氏試驗（VP test）：鉤菌接種於MR-VP培養液中，於35℃培養48 ± 2小時後，取培養液1 mL至另一已滅菌之試管中，加入歐普氏試劑溶液A約0.6 mL及歐普氏試劑溶液B約0.2 mL後，再加入少許肌酸，振搖均勻，經2∼4小時後觀察結果，呈現粉紅色至鮮紅者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.2.5     甲基紅試驗（Methyl red test）：將2.5.2.4節剩餘之MR-VP培養液於35℃再培養48 ± 2小時後，取培養液5 mL至另一已滅菌試管中，加入甲基紅指示劑5∼6滴，輕輕搖勻，呈紅色者為正反應，否則為負反應，大部份阪崎腸桿菌為負反應。

  2.5.2.6     檸檬酸鹽利用試驗（Citrate utilization test）：鉤菌接種於辛蒙斯檸檬酸鹽斜面培養基，須在斜面上作劃線及穿刺培養，於35℃培養96 ± 2小時。斜面上有菌體生長且培養基顏色由綠色變為藍色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.2.7     精胺酸二水解酶試驗（Arginine dihydrolase test）：鉤菌分別接種於精胺酸脫羧酶培養液及脫羧酶基礎培養液中，接種後分別注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1∼2 cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。精胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫羧酶基礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為精胺酸二水解酶正反應。

  2.5.2.8     離胺酸脫羧酶試驗（Lysine decarboxylase test）：鉤菌分別接種於離胺酸脫羧酶培養液及脫羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1∼2 cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。離胺酸脫羧酶培養液呈紫色且脫羧酶基礎培養基呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為負反應。

  2.5.2.9     鳥胺酸脫羧酶試驗（Ornithine decarboxylase test）：鉤菌分別接種於鳥胺酸脫羧酶培養液及脫羧酶基礎培養液中，接種後注入已滅菌之液態石蠟或礦物油覆蓋表面高約1∼2 cm，需鬆蓋，於35℃培養4天，每24小時觀察一次。鳥胺酸脫羧酶培養液呈紫色，且脫羧酶基礎培養液呈黃色者為正反應，否則為負反應，阪崎腸桿菌為正反應。

  2.5.2.10   發酵試驗（Fermentation test）：鉤菌接種於分別含有蔗糖、半乳糖醇、核糖醇、棉子糖、山梨醇及阿拉伯糖醇等糖類之溴甲酚紫培養液中，於35℃培養2∼5天，每隔24小時觀察其發酵情形。培養液顏色由紫色轉變為黃色，產酸者為正反應。

2.6      判定：阪崎腸桿菌陽性者，應符合表一及表二所列之結果。

表一、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之生化反應⁽¹⁾

　　　　(１) ＋ 表示所有菌株在1∼2天內為正反應；[＋] 表示大部分（89%以上）在1∼4天內為正反應；d表示依菌株而異（通常11∼80 %為正反應）；－ 表示所有菌株培養7天後皆為負反應；ND表示無可引用之資料。

表二、E. sakazakii、E. cloacae、E. aerogenes、E. agglomerans及E. gergoviae之發酵試驗⁽¹⁾

　　　　(１) ＋ 表示90∼100%為正反應；(＋) 表示75∼89%為正反應；V 表示25∼74%為正反應；(－) 表示10∼24%為正反應；－ 表示0∼9%為正反應。

 2.7      最確數計算：由2.6節判定為阪崎腸桿菌陽性者之各階瓶（管）數，利用接種量為每瓶（管）0.1, 0.01, 0.001（g或mL）之三階三瓶（管）最確數表（如附表），推算出阪崎腸桿菌之最確數（MPN/g或MPN/mL）。

　　　附表　最確數表

　　　　說明：

　　　　經腸內細菌科增菌培養液增菌培養，劃線至VRBG及ESA培養基，並挑選可疑菌落進行鑑定試驗，確認含有阪崎腸桿菌之試瓶（管）數若為3-3-2，對照MPN數為1100，則：

　　　　(１) 若接種量為每瓶（管）含檢體0.1, 0.01, 0.001（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數為1100（MPN/g或MPN/mL）。

　　　　(２) 若接種量為每瓶（管）含檢體100, 10, 1（g或mL），則該檢體阪崎腸桿菌之最確數應為1100÷1000＝1.1（MPN/g或MPN/mL）。

2.8      可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或生化試驗鑑定系統，惟檢驗結果有爭議時，應以傳統方法為準。